2020年初，一場(chǎng)突如其來的傳染病大流行給全世界帶來了巨大變數(shù)，隨后國(guó)際病毒分類委員會(huì)冠狀病毒研究小組（Coronavirus study group）正式命名新型冠狀病毒（2019-nCoV）為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），這表明新型冠狀病毒從分類學(xué)角度講，是SARS冠狀病毒（SARS-CoV）的近親，與2003年“非典”的罪魁禍?zhǔn)譙ARS病毒部分結(jié)構(gòu)相似，但新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）具有更強(qiáng)的傳染能力和應(yīng)對(duì)溫度變化的能力，并且可在復(fù)制過程中不斷適應(yīng)宿主而產(chǎn)生突變。在此情況下，人類把終結(jié)這一疫情大流行的希望寄托于疫苗的成功研發(fā)，各國(guó)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、企業(yè)紛紛投入疫苗的研制中。
圖1 國(guó)內(nèi)已上市新冠疫苗（不含港澳臺(tái)）從技術(shù)路線上看，新冠疫苗的種類包括滅活疫苗、重組蛋白疫苗、載體疫苗（包括腺病毒載體、減毒流感病毒載體）、核酸疫苗（mRNA疫苗、DNA疫苗）。如圖1所示，目前，國(guó)內(nèi)已上市7款新冠疫苗產(chǎn)品，所屬單位分別是北京生物、武漢生物、科興中維、康希諾、智飛生物、康泰生物及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（以下簡(jiǎn)稱：醫(yī)科院生物所），技術(shù)路線集中在滅活、重組蛋白及腺病毒載體疫苗。上述企業(yè)針對(duì)各自在國(guó)內(nèi)上市的新冠疫苗均布局了相關(guān)專利（如圖1所示），但布局側(cè)重點(diǎn)不同。其中，北京生物、武漢生物、醫(yī)科院生物所采用的技術(shù)路線為滅活疫苗，康希諾生物采用的技術(shù)路線為腺病毒載體疫苗，智飛生物采用的技術(shù)路線為重組蛋白疫苗，上述企業(yè)均布局了疫苗制備方法相關(guān)核心專利（CN111662881B、CN111569058B、CN112546213A、CN111218459B、CN113584106B）。而同樣采用滅活疫苗技術(shù)路線的康泰生物，其全資子公司北京民海生物科技有限公司和科興中維則從疫苗中結(jié)構(gòu)蛋白含量檢測(cè)及滅活疫苗組合物方面布局了相關(guān)專利（CN112225782B、CN113521274A）。接下來筆者將結(jié)合相關(guān)專利信息對(duì)國(guó)內(nèi)已上市新冠疫苗涉及到的三種技術(shù)路線：滅活疫苗、腺病毒載體疫苗、重組蛋白疫苗，以及國(guó)內(nèi)未來新冠疫苗相關(guān)技術(shù)的研發(fā)熱點(diǎn)mRNA疫苗作詳細(xì)介紹。滅活疫苗的原理很簡(jiǎn)單，就是把經(jīng)過滅活的病毒，作為抗原，制成疫苗制劑。滅活疫苗保留了抗原的免疫原性，當(dāng)注射到機(jī)體體內(nèi)后，滅活的病毒顆粒作為抗原物質(zhì)，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，從而使機(jī)體具有抵御該種(型)病毒的能力。目前國(guó)內(nèi)已上市的七款新冠疫苗中，有五款為滅活疫苗，其中包括北京生物、武漢生物、科興中維等。我們從專利中可以大致看出滅活疫苗的生產(chǎn)工藝。以北京生物為例，其在專利CN111662881B中公開了一種新型冠狀病毒SARS-CoV-2的Vero細(xì)胞滅活疫苗病毒液的生產(chǎn)方法，包括在裝填有片狀載體的籃式生物反應(yīng)器中加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種Vero細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，至長(zhǎng)成致密單層后，采用細(xì)胞維持液洗換；洗換結(jié)束后注入細(xì)胞維持液，進(jìn)行新型冠狀病毒的接種，病毒接種的MOI為0.005～0.4，病毒培養(yǎng)溫度為36±1℃，溶氧≥40％，控制病毒培養(yǎng)階段體系pH值為7.2～7.6；病毒接種后培養(yǎng)48～96h，收獲病毒液。該方法應(yīng)用籃式反應(yīng)器成功培養(yǎng)獲得了新型冠狀病毒Vero細(xì)胞滅活疫苗病毒液，細(xì)胞接種密度大，病毒滴度高，批間差異高度可控且質(zhì)量均一。其另一篇相關(guān)專利CN111575249B公開了一種新型冠狀病毒SARS-CoV-2的Vero細(xì)胞滅活疫苗病毒液的純化方法，包括將滅活的新型冠狀病毒SARS-CoV-2的Vero細(xì)胞病毒液通過濾膜初步過濾，然后通過濾膜超濾濃縮得到新型冠狀病毒濃縮液后加入核酸酶，降解Vero細(xì)胞中殘留的DNA，之后將復(fù)合填料Capto Core 700裝入層析柱中，先采用堿液沖洗，再用洗脫液平衡2～5個(gè)柱體積，接著將病毒濃縮液泵入到層析柱中，洗脫液洗脫；在紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm條件下，收集第一個(gè)流穿峰即為病毒純化液。該方法采用超濾濃縮、核酸酶消化和柱層析工藝步驟，結(jié)合復(fù)合填料Capto Core 700對(duì)新型冠狀病毒液進(jìn)行純化，能夠快速、穩(wěn)定地大規(guī)模生產(chǎn)新型冠狀病毒Vero細(xì)胞滅活疫苗病毒純化液。從北京生物相關(guān)專利公開的內(nèi)容可以發(fā)現(xiàn)，新冠滅活疫苗生產(chǎn)工藝大致為應(yīng)用籃式生物反應(yīng)器制備新型冠狀病毒滅活疫苗(Vero細(xì)胞)病毒液，經(jīng)過病毒培養(yǎng)、滅活、純化，后經(jīng)適當(dāng)稀釋后配制新型冠狀病毒滅活疫苗，配制后分裝，得到新型冠狀病毒Vero細(xì)胞滅活疫苗制品。腺病毒載體技術(shù)簡(jiǎn)單來說就是把腺病毒中原有與復(fù)制相關(guān)的基因剔除，替換為新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）的基因。這樣做的目的是使重新組裝的病毒復(fù)制新冠病毒刺突蛋白，從而刺激我們的免疫系統(tǒng)啟動(dòng)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫記憶。目前國(guó)內(nèi)上市的腺病毒載體新冠疫苗是由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院陳薇院士團(tuán)隊(duì)及康希諾生物聯(lián)合研發(fā)的。康希諾相關(guān)專利CN111218459B中公開了制備重組腺病毒的方法：以E1、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒為載體，以整合腺病毒E1基因的HEK293細(xì)胞為包裝細(xì)胞系，攜帶的保護(hù)性抗原基因是經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計(jì)的2019新型冠狀病毒(SARS?CoV?2)S蛋白基因(Ad5?nCoV)，通過構(gòu)建穿梭質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞、培養(yǎng)宿主細(xì)胞、收獲宿主細(xì)胞中釋放的人復(fù)制缺陷重組腺病毒、對(duì)重組腺病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、純化等步驟來制備所需的重組腺病毒。該方法中S蛋白基因經(jīng)優(yōu)化后，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高，且疫苗制備快速簡(jiǎn)便，可在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)用于應(yīng)對(duì)突發(fā)疫情。此外值得一提的是，10月26日，由康希諾研制的全球首款吸入用重組新型冠狀病毒疫苗(5型腺病毒載體)(簡(jiǎn)稱“吸入式新冠疫苗”)在上海正式開始免費(fèi)接種，這款疫苗與其此前已經(jīng)獲得附條件上市批準(zhǔn)的注射用新冠疫苗“克威莎”同屬一款疫苗，在肌注型腺病毒載體新冠疫苗“克威莎”的基礎(chǔ)上創(chuàng)新給藥方式，用霧化器將疫苗霧化成微小顆粒，通過口腔吸入的方式完成接種。圖2 吸入式新冠疫苗（圖源：康希諾生物官網(wǎng)）對(duì)于吸入式新冠疫苗，康希諾在專利方面“早有準(zhǔn)備”，早在2020年8月24日康希諾就申請(qǐng)了給藥方式為黏膜給藥的SARS-CoV-2重組腺病毒載體疫苗相關(guān)專利（CN113750227A）并申請(qǐng)了PCT國(guó)際專利，隨后更是布局了多件霧化裝置相關(guān)專利（詳見圖3）。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所與安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司聯(lián)合研發(fā)的重組蛋白新冠疫苗是我國(guó)首個(gè)獲批的重組新冠病毒蛋白疫苗，是將新冠病毒最重要的抗原部分，放到一個(gè)工程細(xì)胞系里面來生產(chǎn)，然后將它生產(chǎn)出的抗原蛋白經(jīng)過純化，再與佐劑進(jìn)行混合，最后接種到人體內(nèi)。關(guān)于其生產(chǎn)工藝，智飛生物在專利CN113584106B中公開了一種CHO細(xì)胞表達(dá)的重組新型冠狀病毒NCP-RBD蛋白的制備方法，包括取工作細(xì)胞株（表達(dá)重組新型冠狀病毒NCP?RBD蛋白的重組CHO細(xì)胞株）進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，得到細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)物后將細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)物進(jìn)行擴(kuò)增，得到細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)物，之后將細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)物進(jìn)行罐培養(yǎng)，得到細(xì)胞收獲液，最后將細(xì)胞收獲液進(jìn)行純化，得到所需產(chǎn)物。該方法可以將CHO細(xì)胞表達(dá)的重組新型冠狀病毒NCP?RBD蛋白高效的分離和純化，適用于規(guī)?；a(chǎn)，同時(shí)能有效地用于生產(chǎn)新冠疫苗。智飛生物關(guān)于重組蛋白新冠疫苗的制備方法，將最有效的抗原成份通過基因工程的方法，在體外細(xì)胞中表達(dá)，通過類似于工業(yè)發(fā)酵的方式（即生物反應(yīng)器）來生產(chǎn)蛋白，經(jīng)過純化后制成疫苗，整個(gè)生產(chǎn)過程僅涉及蛋白表達(dá)和純化，沒有活病毒，因此生產(chǎn)過程安全性好，容易大規(guī)模生產(chǎn)。根據(jù)相關(guān)研究，目前滅活疫苗無法有效應(yīng)對(duì)病毒突變，而mRNA疫苗在刺激細(xì)胞免疫方面具有一定優(yōu)勢(shì)，此外mRNA疫苗產(chǎn)業(yè)化容易、速度快、成本低，從基因測(cè)序至生產(chǎn)只需要數(shù)周的時(shí)間，因此在對(duì)時(shí)間要求比較緊急的疫情中有望發(fā)揮重要作用。此外，mRNA技術(shù)在理論上可以生產(chǎn)出任何一種人類所需的蛋白質(zhì)，在傳染性疾病以外的領(lǐng)域應(yīng)用前景也非常廣闊，由此可見，mRNA技術(shù)的價(jià)值是不言而喻的，是未來各國(guó)相關(guān)企業(yè)的研發(fā)重點(diǎn)。雖然目前國(guó)內(nèi)尚無mRNA 新冠疫苗獲批，但在新冠mRNA疫苗賽道上，超10家藥企已有相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)和專利布局，例如沃森生物、艾博生物、斯微生物、艾美疫苗、深信生物、威斯津生物、康希諾、石藥集團(tuán)、藍(lán)鵲生物、復(fù)星醫(yī)藥等。然而，mRNA技術(shù)存在兩大關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)：序列設(shè)計(jì)和遞送系統(tǒng)，其中mRNA序列結(jié)構(gòu)決定抗原蛋白結(jié)構(gòu)、免疫原性及穩(wěn)定性，優(yōu)秀的序列設(shè)計(jì)可以更高效地表達(dá)抗原蛋白，最終提高mRNA疫苗激活特異免疫的精確性和活性。而遞送系統(tǒng)是目前產(chǎn)能擴(kuò)張的瓶頸，也是目前mRNA疫苗的主要研發(fā)壁壘。由于mRNA很難通過細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)雙分子膜層以及mRNA具有的高天然免疫原性，其在體內(nèi)傳遞效率低下，難以高效率地發(fā)揮作用，因此要實(shí)現(xiàn)mRNA疫苗的廣泛應(yīng)用，高效的遞送系統(tǒng)是關(guān)鍵。在遞送系統(tǒng)方面，主流方法是采用LNP（脂質(zhì)納米粒）技術(shù)遞送，LNP將mRNA包載其中，保護(hù)mRNA免于遞送過程的酶降解和免疫系統(tǒng)的清除，提高mRNA體內(nèi)穩(wěn)定性，促進(jìn)其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)且在細(xì)胞質(zhì)中釋放mRNA用于翻譯蛋白，蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體免疫。目前，國(guó)際公認(rèn)的mRNA巨頭公司分別是Moderna、BioNTech和CureVac。但LNP技術(shù)的專利卻并不屬于這三家公司，LNP技術(shù)專利最開始由加拿大生物藥企Arbutus所掌握，曾授權(quán)給Moderna、CureVac和BioNtech。后來Moderna選擇自主研發(fā)，只不過Moderna在與Arbutus的LNP專利糾紛中敗訴，而BioNTech及CureVac在mRNA疫苗中使用的LNP載體，則明確是來自Arbutus的專利授權(quán)。針對(duì)LNP遞送技術(shù)，Arbutus申請(qǐng)了多項(xiàng)針對(duì)性的保護(hù)專利，其LNP遞送系統(tǒng)的核心專利US8058069B2（中國(guó)同族專利為CN102119217B）保護(hù)范圍包含核酸、陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)、綴合脂質(zhì)以及各成分的比例，對(duì)LNP組合物的組份及其配比進(jìn)行了非常全面的保護(hù)，在2029年專利到期之前難以撼動(dòng)。
圖4 Arbutus的LNP遞送系統(tǒng)核心專利
由于LNP的專利難以突破，如果企業(yè)不想通過授權(quán)使用，只能從發(fā)起專利挑戰(zhàn)或規(guī)避設(shè)計(jì)方面做文章，規(guī)避設(shè)計(jì)如采用區(qū)別于專利中陽離子脂質(zhì)體的脂質(zhì)或通過改變各組分配比實(shí)現(xiàn)優(yōu)化，以尋求繞過現(xiàn)有專利的可能。目前，許多國(guó)內(nèi)相關(guān)企業(yè)也想突破國(guó)外企業(yè)的專利壁壘，采用改進(jìn)的LNP，并且已經(jīng)開始布局相關(guān)專利，其中深信生物于2020年8月申請(qǐng)了相關(guān)專利“一種脂質(zhì)納米顆?！保–N114073677A），艾博生物于2021年8月申請(qǐng)了相關(guān)專利“脂質(zhì)化合物和脂質(zhì)納米顆粒組合物”（CN114391008A），康希諾與鍵凱科技于2022年1月申請(qǐng)了相關(guān)專利“一種用于核酸遞送的新型可電離脂質(zhì)及其LNP組合物”（CN114149337B）并獲得授權(quán)。這種方法理論上可行，但真正能投入使用可能還需要一定時(shí)間。此外值得一提的是，與現(xiàn)階段大部分企業(yè)都采用的LNP遞送系統(tǒng)不同，斯微生物采用LPP遞送系統(tǒng)，由其聯(lián)合創(chuàng)始人沈海法研發(fā)，巧妙地繞開了LNP結(jié)構(gòu)專利，并于2017年獲得美國(guó)休斯頓衛(wèi)理公會(huì)醫(yī)院LPP遞送平臺(tái)全球獨(dú)家商業(yè)化授權(quán)。據(jù)斯微生物官網(wǎng)介紹，LPP (lipopolyplex) 納米遞送平臺(tái)是一種以聚合物包載mRNA為內(nèi)核、磷脂包裹為外殼的雙層結(jié)構(gòu)，LPP的雙層納米粒和傳統(tǒng)的LNP相比具有更好的包載、保護(hù)mRNA的效果，并能夠隨聚合物的降解逐步釋放mRNA分子，LPP平臺(tái)優(yōu)異的樹突狀細(xì)胞靶向性可以更好地通過抗原遞呈激活T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到理想的免疫治療效果。綜合來看，國(guó)內(nèi)相關(guān)企業(yè)已具備專利預(yù)警和避開專利壁壘的前期意識(shí)，同時(shí)正憑借自身研發(fā)能力布局具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的關(guān)鍵專利技術(shù)，國(guó)產(chǎn)新冠疫苗競(jìng)爭(zhēng)力進(jìn)一步加強(qiáng)，在未來新冠疫苗領(lǐng)域的全球競(jìng)爭(zhēng)中，中國(guó)企業(yè)有望占據(jù)更有利的地位。作者：朱江月 品源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理
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